Oligonukleotidsynthese

Oligonukleotidsynthese für innovative F&E in den Biowissenschaften

Obwohl der Bedarf kundenspezifischer Oligonukleotidsynthese in der Wirkstoffforschung sowie Lebenswissenschaften ein hohes Wachstum erfahren hat, sind Dienstleister für solche Nukleotide von hochwertiger Qualität nicht leicht zu finden. Da wir über umfangreiches Know-how in der Auftragssynthese sowie in der Medizinalchemie verfügen und nicht mit automatisierten Synthesizern arbeiten, sind unsere erfahrenen Chemiker auf die Herausforderungen einer anspruchsvollen Oligonukleotidsynthese sowie innovative Nukleotidsequenzen spezialisiert, z.B. mit speziellen Labels und Modifikationen. Somit bieten wir keine Standardnukleotide sondern ausschließlich eine kundenspezifische Oligosynthese für die individuellen Anforderungen unserer meist forschenden Kunden an. Diese Oligonukleotide werden mit definierten Sequenzen synthetisiert und können mit chemischen Strukturen modifiziert werden, um so in einer Vielzahl von molekularbiologischen Anwendungen eingesetzt zu werden, die von Sequenzierung, gezielter Mutagenese und Mikroarrays bis hin zu PCR, real-time PCR und verschiedener therapeutischer Anwendungen reichen.

Auswahl an kundenspezifischen Modifikationen und Labels:

  • Unnatürliche und außergewöhnliche Nukleoside oder Nukleotide

 

  • Thiophosphat-Analoga: chirale Thiophosphat-Einheit

 

  • Isotopenmarkierte Nukleoside oder Nukleotide

 

  • Fluoreszierend markierte Nukleoside oder Nukleotide

 

  • Biotinylierte und markiertese Nukleoside oder Nukleotide

 

  • Zyklische Nukleotide, cGMPs

 

  • Verschiedene Linker, Spacer und PEGs

 

  • Backbone- und Cross-Linker-Modifikationen

 

  • Basenmodifikationen und invertierte Basen

 

  • Phosphorylierung

 

  • Photoaktivierbare Label

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    Performing synthetic chemistry and medicinal chemistry to yield novel organic compounds with druglike physicochemical properties

    In der medizinalchemischen Forschung sowie medizinische Chemie arbeiten wir mit einem Team, welches breite Erfahrung auf biomolekularen Targets aus allen…

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    Oligonukleotidsynthese für vielfältige Forschungsanwendungen

    Wir bieten seit 1999 Auftragssynthesen mit hohen Erfolgsraten und sind aufgrund unserer Kompetenz in moderner Synthesechemie in der Lage die passende Oligonukleotid Synthesemethode für Ihre Zwecke zu optimieren! Unsere erfahrenen Chemiker sind darin geschult, Sie vor der Synthese sowie beim Versuchsdesign zu beraten. Dabei profitieren Sie von unserer Kundenbetreuung mit einem durchgehenden Ansprechpartner bzw. Projektmanager, welches eine effektive Kommunikation zum Fortschritt des Projekts und Lösung potentieller Probleme sicherstellt. Wir können Ihnen bei der Auswahl des spezifischen Oligos oder synthetischen Nukleotids helfen und Sie bei der Auswahl der erforderlichen Nukleotidspezifikationen (Taros findet die richtigen Spezifikationen für z.B. Reinheit und Menge des Nukleotids, Modifikationen, Analysemöglichkeiten und Lieferformate). Nach jeder Oligonukleotidsynthese bieten wir eine routinemäßige Analyse des Produkts durch 1H-NMR, 31P-NMR, LC-MS oder HPLC an, um die genaue Struktur, Identität und Qualität des kundenspezifischen Targets zu bestätigen. Dadurch sind unsere bereitgestellten Oligos für Anwendungen in der Molekularbiologie und therapeutischen Forschung geeignet. Bei der Oligonukleotidsynthese verwendet  Taros die Gefriertrocknung zur schonenden Trocknung und Stabilisation, sodass lyophilisierte Produkte viel länger bei der geeigneten Temperatur gelagert werden können. Detaillierte Informationen zu unseren Dienstleistungen und praktische Fragestellungen finden Sie in unserem Taros FAQ.

    Welche Methoden verwendet Taros zur Synthese von maßgeschneiderten Oligonukleotiden?

    Die bei Taros am häufigsten verwendete Methode ist die Phosphoramidit-Synthese, in Lösung oder in Festphase. Für diejenigen, die mit dieser Methode nicht vertraut sind, möchten wir diesen vierstufigen Zyklus der Nukleotidsynthese erklären:

    Um Nukleotide zu einem gewünschten Oligopeptid zu koppeln, setzen viele Hersteller auf das bekannte und hoch optimierte Phosphoamidit-Syntheseverfahren. Dabei wird eine feste Syntheseplattform (z. B. ein Harz) als Basis für die Synthese verwendet. Sobald das richtige Ausgangsnukleotid oder die richtige Modifikation mit der Plattform gekoppelt wurde, beginnt ein vierstufiger Zyklus, bei dem ein Nukleotid nach dem anderen hinzugefügt wird.

    Jeder Zyklus besteht aus einer Entblockung, Kopplung, Verkappung („Capping“) und Oxidation für jede Zugabe eines A, C, T oder G-Nukleotids.

    1. Entblockung/Entschützung:

    Um eine Nukleotidaddition von 3’→5′ durchzuführen, muss zunächst die Schutzgruppe Dimethoxytrityl (DMT) am 5′-Kohlenstoff des aufnehmenden Oligopeptids entfernt werden. Dies wird erreicht, indem das wachsende Oligo mit einem Deblockierungsreagenz behandelt wird, welches die Schutzgruppe abspaltet und den Zugang zu einer freien 5′-Hydroxylgruppe ermöglicht. Diese Hydroxylgruppe ist in der Lage, mit dem nächsten Nukleotid zu reagieren und dieses zu binden.

    2. Kopplung:

    Sobald die 5′-Hydroxylgruppe zugänglich ist, kann das Oligo an das nächste Nukleotid in der Oligosequenz gekoppelt werden. Das gewünschte Nukleotid wird in die Reaktion eingeführt und reagiert mit einer schwachen Säure, wodurch ein Phosphoramidit-Zwischenprodukt entsteht. Sobald diese Umwandlung stattgefunden hat, wird die Interaktion des Nukleotids mit der nicht blockierten Hydroxylgruppe am 5′-Ende des wachsenden Oligos ermöglicht, was zu einer kovalenten Bindung des neuen Nukleotids durch eine Phosphittriesterbindung führt.

    3. Kappen („Capping“):

    Obwohl diese Methode schon seit langer Zeit bekannt ist und viele Optimierungen bereits vorgenommen wurden, ist eine 100%ige Genauigkeit der Kopplung nicht möglich. Selbst mit sehr reinen Reagenzien und präziser Chemie werden einige 5′-Hydroxylgruppen im vorherigen Schritt nicht gekoppelt, so dass eine freie 5′-Hydroxylgruppe bestehen bleibt. Wenn diese nicht blockiert wird, kann diese sehr reaktive Gruppe im nächsten Zyklus an ein neues Nukleotid koppeln, was zu einer Sequenz mit einer Deletion führt. In der Folge würde dies zu verschiedenen Sequenzen führen, die Deletionen in verschiedenen Positionen der gewünschten Sequenz enthalten. Dies lässt sich leicht vermeiden, indem das abgekoppelte Molekül mit einer Kappe versehen wird, um seine Verlängerung in den nächsten Zyklen zu verhindern. Durch die Entfernung dieser trunkierten Sequenzen in den Reinigungsschritten, die auf die Synthese folgen, soll das unvermeidliche Vorhandensein von verkürzten Molekülen im Endprodukt minimiert werden. Auf diese Weise erzielt das Verfahren sehr hohe Kopplungseffizienzen bei einem geringen Anteil an verkürzten oder fehlgeschlagenen Produkten.

    4. Oxidation:

    Die neu gebildete Phosphittriesterbindung der reaktiven Nukleotidsequenz muss im letzten Schritt des Zyklus stabilisiert werden. Dies wird erreicht, indem der Reaktion ein Oxidationsgemisch zugesetzt wird, welches das Phosphit zu einem Phosphat oxidiert, was wiederum zu einer stabilen Phosphotriesterbindung zwischen den beiden Nukleotiden führt. Sobald diese stabilisiert ist, ist das wachsende Oligopeptid bereit, in einem neuen Zyklus ein neues Nukleotid in seine Sequenz aufzunehmen.

    Dieser Zyklus wiederholt sich so oft wie nötig, um die gewünschte Oligonukleotidsequenz zu erhalten. Sobald das letzte Nukleotid an die Sequenz fusioniert ist, werden die Oligos einem Prozess unterzogen, der das gesamte Molekül durch Entfernen der noch vorhandenen Schutzgruppen in seinen naiven Zustand versetzt. Dazu gehört auch die Entfernung der DMT-Gruppe, die das letzte Nukleotid blockiert, sowie verschiedener nukleotidspezifischer Schutzgruppen. Sobald alles entfernt ist, wird das Oligo von der festen Syntheseplattform abgespalten und extrahiert. Schließlich erhält man das endgültige und funktionsfähige einzelsträngige DNA-Molekül, das zur Aufreinigung weiterverarbeitet werden kann.